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Jun 29, 2023

Repulsión entrópica del colesterol.

Nature volumen 618, páginas 733–739 (2023)Cite este artículo 12k Accesos 75 Detalles de Altmetric Metrics El control de la adhesión es una característica sorprendente de la materia viva que es de particular interés con respecto a

Nature volumen 618, páginas 733–739 (2023)Cite este artículo

12k Accesos

75 altmétrico

Detalles de métricas

El control de la adhesión es una característica sorprendente de la materia viva que resulta de particular interés en lo que respecta a la traducción tecnológica1,2,3. Descubrimos que la repulsión entrópica causada por fluctuaciones de orientación interfacial de las capas de colesterol restringe la adsorción de proteínas y la adhesión bacteriana. Además, encontramos que las capas de éster de cera intrínsecamente adhesivas se vuelven igualmente antibioadhesivas cuando contienen pequeñas cantidades (menos del 10% en peso) de colesterol. Los experimentos de humectación, adsorción y adhesión, así como las simulaciones atomísticas, demostraron que las características repulsivas dependen de la estructura molecular específica del colesterol que codifica una reorientación fluctuante finamente equilibrada en la interfaz de conjuntos supramoleculares no restringidos: capas de análogos del colesterol que difieren sólo en variaciones moleculares diminutas. mostraron una movilidad interfacial marcadamente diferente y ningún efecto antiadhesivo. Además, las capas de colesterol fijadas direccionalmente no resistieron la bioadhesión. Nuestros conocimientos proporcionan una perspectiva fisicoquímica conceptualmente nueva sobre las biointerfaces y pueden guiar el diseño futuro de materiales en la regulación de la adhesión.

La vida ha desarrollado una gran cantidad de principios poderosos para controlar la adhesión, algunos de los cuales se han recapitulado en materiales de ingeniería. Ejemplos destacados incluyen las hojas superhidrófobas del loto sagrado1 y las superficies omnifóbicas de la planta jarra Nepenthes2. Mientras que los fenómenos interfaciales en la naturaleza se estudian ampliamente, los mecanismos físicos subyacentes al control de la bioadhesión (la acumulación interfacial de biopolímeros y células (incluidas las bacterias)) aún no se comprenden completamente. Anteriormente exploramos la cutícula omnifóbica y antibioadhesiva de Collembola (Fig. 1a) y descubrimos que consta de estructuras nanoscópicas con perfiles transversales sobresalientes (Fig. 1b, c) que evitan la humectación y la colonización bacteriana 3,4,5,6. Más tarde, se demostró que la envoltura rica en lípidos de la cutícula de Collembola (Fig. 1c), considerada como otra "línea de defensa" contra la bioadhesión, contenía hidrocarburos alifáticos, en particular esteroides, ácidos grasos y ésteres de cera (Fig. 1d y Datos ampliados Fig. 1)7. Mientras que se puede suponer razonablemente que los ésteres de cera respaldan las propiedades no humectantes de la cutícula8, el papel de los esteroides y los ácidos grasos sigue siendo difícil de alcanzar. Se ha informado que los ácidos grasos libres matan o inhiben el crecimiento de bacterias y hongos9,10, y se ha descubierto que los esteroides reducen la bioadhesión en esponjas y estrellas de mar11; sin embargo, no se dispone de una explicación mecanicista para este efecto de los esteroides. Los componentes lipídicos anfifílicos de la cutícula de Collembola también están contenidos en las membranas de células animales y bacterianas que desempeñan funciones clave en la compartimentación y la alineación funcional de las maquinarias moleculares12. El colesterol, en particular, ha sido ampliamente estudiado y su presencia se considera crucial para la regulación de dominios lipídicos funcionales y la interacción entre proteínas y lípidos13. Sin embargo, la relevancia funcional del colesterol en las interfaces de estructuras vivas distintas de las membranas celulares está poco explorada.

a, Imagen de Tetrodontophora bielanensis, un ejemplar de Collembola sp. Barra de escala, 1 mm. b, Imagen de microscopía electrónica de barrido de una cutícula de T. bielanensis. Barra de escala, 500 nm. c, Esquema transversal de la cutícula, que muestra una estructura en capas que consta de un esqueleto interno rico en quitina cubierto por una capa rica en proteínas. Una fina envoltura rica en lípidos cubre la capa rica en proteínas. Barra de escala, 200 nm. d, Resumen de lípidos detectados en la capa cuticular externa de T. bielanensis7. e, capas de lípidos cuticulares de Collembola; Los SCL que contienen colesterol facilitan la adaptación orientativa de los lípidos superiores a la polaridad del medio ambiente. Las mediciones de ATR-FTIR (Figura 2 complementaria) y del ángulo de contacto dinámico (Figura 2c y Figura 4a de datos ampliados) indican moléculas de colesterol altamente ordenadas, con la cola de hidrocarburo de la capa externa de colesterol inicialmente orientada hacia la interfaz y los grupos hidroxilo orientados. interior. Los SAM quimisorbidos en oro a través de grupos tiol, con el lado polar o no polar del colesterol orientado hacia la interfaz, sirvieron como referencia en experimentos seleccionados. f – i, cantidad adsorbida de proteína (f, i) y células adherentes normalizadas (g, h). Cantidad adsorbida de proteína (lisozima o suero bovino fetal) en capas monocomponente de lípidos cuticulares de Collembola (f) y SCL multicomponente de palmitato de estearilo y colesterol (i), según lo determinado mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. Células adherentes normalizadas de S. epidermidis en capas monocomponentes de lípidos cuticulares de Collembola (g) y SCL multicomponentes de palmitato de estearilo y colesterol (h). Datos normalizados a la densidad celular adherente promedio sobre un sustrato de sílice (SiO2). h, i, SCL de palmitato de estearilo puro (100/0) y SCL de colesterol puro (0/100) sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. f–i, Media + sd Se indica el número de observaciones (n). Los valores de P (comparación con la condición de colesterol SCL en f,g y con la condición 0/100 en h,i) se determinaron mediante análisis de varianza unidireccional. AU, unidades arbitrarias.

Datos fuente

Utilizando capas lipídicas sin las características morfológicas de la cutícula, analizamos el papel de los ensamblajes moleculares en el control de la bioadhesión a partir de los efectos de la topografía antiadhesiva de la cutícula de Collembola5,14. Se descubrió que las capas lipídicas que contienen colesterol contrarrestan la bioadhesión mediante un mecanismo de repulsión entrópica previamente desconocido que, a diferencia de los efectos interfaciales informados anteriormente15,16,17, es causado por fluctuaciones de orientación.

Los lípidos de la cutícula de Collembola (Fig. 1d) se fisiosorbieron en múltiples capas sobre soportes sólidos mediante recubrimiento por rotación (multicapas lipídicas recubiertas por rotación, SCL; Fig. 1e). Para los SCL de colesterol, la espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier de reflexión total atenuada (ATR-FTIR) mostró una estructura multicapa con la mayoría de las moléculas orientadas perpendicularmente a la interfaz (Figura complementaria 2) 18, 19. Las monocapas autoensambladas (SAM; Fig. 1e) quimisorbidas en oro sirvieron como un análisis comparativo de los componentes lipídicos de la cutícula investigados en orientaciones moleculares geométricamente limitadas (Datos ampliados, Figs. 1 y 2a-c).

Una característica distintiva de la bioadhesión es la formación de una capa de acondicionamiento molecular de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y otras biomoléculas20. Este proceso fue imitado mediante experimentos de adsorción con lisozima y albúmina, y los resultados mostraron cantidades de proteínas adsorbidas significativamente menores en las SCL de colesterol que en todas las demás SCL y SAM estudiadas (Fig. 1f y Datos ampliados Fig. 2f, g). Asimismo, se encontró que la adhesión de bacterias Gram-positivas (Staphylococcus epidermidis, cepa PCI 1200) y Gram-negativas (Escherichia coli, cepa W3110) era muy baja en los SCL de colesterol (Fig. 1g y Datos ampliados Fig. 2d, e). Mediante el análisis de los SCL de colesterol de diferentes espesores de capa (Figura complementaria 3a), se podría excluir cualquier influencia del espesor de múltiples capas sobre las propiedades antiadhesivas. En particular, SAM de tiocolesterol y amida del ácido N-(2-mercaptoetil)-3-hidroxi-5-colénico (ácido tioclénico), es decir, sustitutos de monocapas de colesterol fijadas químicamente de alineación molecular de orientación opuesta; Fig.1e): acumuló mayores cantidades de proteína adsorbida y bacterias adherentes que los SCL de colesterol (Fig. 1f, gy Datos ampliados Fig. 2d-g). Esta observación sugiere que la restricción de la movilidad molecular en el colesterol en capas impide las propiedades antiadhesivas. La disolución parcial de los SCL de colesterol se excluyó como causa de baja bioadhesión mediante el análisis del contenido de carbono orgánico total (Figura complementaria 4).

Debido a que el colesterol se encuentra en la cutícula de Collembola junto con varios otros componentes lipídicos (Fig. 1d), investigamos más a fondo su relevancia con respecto a las características adhesivas de las SCL multicomponentes. Se investigaron SCL multicomponente que contienen palmitato de estearilo, un lípido que causa una fuerte bioadhesión a sus SCL de un solo componente (Fig. 1f,g y Datos ampliados Fig. 2d,g), y colesterol, con un contenido de colesterol que oscila entre 0 y 100% en peso. utilizando ensayos de bioadhesión similares (Datos ampliados, figuras 3a-c). Las SCL multicomponentes que contienen al menos un 10% en peso de colesterol mostraron bajas densidades de células adherentes similares a las SCL de colesterol puro (Fig. 1h y Datos ampliados, Fig. 3d). Del mismo modo, la adsorción de proteínas en SCL multicomponente se redujo significativamente cuando estaba presente un mínimo de solo 1% en peso de colesterol (Datos ampliados, Fig. 3e, f). Los resultados de los experimentos de adsorción de una sola proteína se confirmaron cuando se aplicaron mezclas de proteínas fisiológicamente relevantes (es decir, 10% en volumen de suero bovino fetal; Fig. 1i).

Los resultados de los ensayos de bioadhesión sugieren que la movilidad del colesterol interfacial es clave para las características antiadhesivas de las SCL monocomponentes y multicomponentes. La espectroscopia de fuerza de sonda coloide basada en microscopía de fuerza atómica (AFM), la espectroscopia de fuerza unicelular basada en AFM y las mediciones del ángulo de contacto dinámico proporcionaron más información sobre la dinámica interfacial subyacente.

La espectroscopía de fuerza basada en AFM (Figuras complementarias 5a, by Métodos) mostró la adaptación interfacial dinámica de las SCL de colesterol sumergidas. Se cuantificaron las fuerzas de interacción entre sondas coloidales hidrófobas (Fig. 5c complementaria) o células individuales de E. coli y SCL de colesterol (Fig. 5d complementaria) y se encontró que aumentaban continuamente con el tiempo de contacto (Fig. 2a, b). Un análisis más detallado mostró que la cinética de tercer orden controlaba el proceso de adaptación de la polaridad subyacente de la interfaz SCL para maximizar las interacciones hidrofóbicas (Fig. 2a, by Nota complementaria 1). Los experimentos de control con SAM de tiocolesterol y ácido tioclénico confirmaron que la movilidad del colesterol dentro de los SCL es clave para la adaptación observada (Fig. 2a, b).

a,b, Fuerzas de interacción dependientes del tiempo de contacto (determinadas mediante espectroscopia de fuerza basada en AFM) entre una sonda coloidal hidrófoba (a) (cuenta de sílice de ∅10 µm modificada con un silano hidrófobo) o células individuales de E. coli (b) (adjuntas a una perla de sílice de ∅10 µm) y SCL de colesterol o SAM de tiocolesterol y ácido tiocolénico. Los experimentos se realizaron a 37 °C. a,b, Media ± sem Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Las regresiones son las soluciones que mejor se ajustan a un proceso de tercer orden que indica la formación de enlaces en la interfaz celda sonda-SCL siguiendo \(\frac{{\rm{d}}\sigma }{{\rm{d}}t} =-\,k{\sigma }^{3}\) (para más detalles, consulte la Nota complementaria 1). Se supuso que la fuerza de interacción estaba directamente correlacionada con la concentración superficial de los enlaces formados, σ. Se muestran los coeficientes de determinación (R2) para ajustes. c, Imágenes representativas que muestran los ángulos de contacto dinámicos del agua en la superficie de un SCL de colesterol. El alto ángulo de contacto de avance (θadv, cuadro azul) refleja una superficie hidrofóbica. Después de la retirada inmediata de la gota (sin período de descanso, cuadro verde), se observó un ángulo de contacto de retroceso (θrec) ligeramente reducido pero aún alto. No se observó retroceso de la línea de contacto trifásica cuando se retiró la gota de agua después de un período de reposo de 20 s (cuadro rojo). d, Durante el período de reposo de 20 s, se observaron oscilaciones en la línea de contacto trifásica entre el ángulo de avance inicial (93°) y un ángulo inferior de aproximadamente 10°.

Datos fuente

Los experimentos de humectación dinámica en SCL de colesterol en el aire mostraron ángulos de contacto de agua altos de avance y retroceso cuando la gota se retiró inmediatamente después de la deposición (Fig. 2c, Datos ampliados, Fig. 4a y Video complementario 1), lo que indica que las cadenas de hidrocarburos de las capas externas de colesterol acondicionados con aire están orientados preferentemente hacia la interfaz. Si la gota de agua se mantuvo en la superficie durante 20 s antes de retroceder, se produjeron oscilaciones de la línea de contacto trifásica durante 15 a 20 s y, posteriormente, el ángulo de contacto estático disminuyó aproximadamente 10 ° (Fig. 2d y video complementario 2). . Se observó fijación de la línea de contacto trifásica cuando se retiró la gota (Fig. 2c, Datos ampliados, Fig. 4a y Video complementario 2). Se descubrió que la caída del ángulo de contacto era completamente reversible después del secado en gas inerte (Datos ampliados, figura 4d). La disminución del ángulo de contacto dependiente del período de reposo, la línea de contacto trifásica oscilante durante el período de reposo y el aumento de la histéresis del ángulo de contacto confirman una adaptación dinámica de la polaridad del colesterol en la interfaz de los SCL en respuesta a cambios en la polaridad de el entorno.

La dependencia del tiempo del aumento en la fuerza de interacción entre las SCL de colesterol y las sondas AFM (Fig. 2a) y las células bacterianas individuales (Fig. 2b), así como la disminución en el ángulo de contacto del agua en retroceso en las SCL de colesterol (Fig. 2c), indican que el proceso de adaptación de la polaridad interfacial de los SCL de colesterol es relativamente lento (es decir, ocurre durante un período de unos pocos segundos).

También respaldando los resultados de los ensayos de bioadhesión (Fig. 1h, i y Datos ampliados Fig. 3d – f), cantidades bajas de colesterol en SCL multicomponentes de colesterol y palmitato de estearilo fueron suficientes para disminuir el ángulo de contacto con el agua en retroceso (Datos ampliados Fig. 4c ) y para aumentar la fuerza de interacción con sondas AFM hidrófobas (Datos ampliados, Fig. 3h).

Anteriormente se demostró que las propiedades antibioadhesivas de las SCL que contienen colesterol se correlacionan con una adaptación dinámica de la orientación interfacial del colesterol en respuesta a cambios en la polaridad ambiental. Nuestra hipótesis es que las fluctuaciones de orientación entrópicamente impulsadas de las moléculas de colesterol interfacial conectan mecánicamente estas características: cualquier adsorción de biomoléculas o unión de células (bacterianas) requiere una adaptación de orientación (polaridad) de la interfaz SCL que limita los estados de orientación del colesterol interfacial y, por lo tanto, reduce la entropía del sistema.

Para validar esta hipótesis, primero examinamos el sistema para determinar la dependencia característica de la temperatura de los efectos entrópicos sobre la adsorción de proteínas (de acuerdo con la definición de energía libre de adsorción de Gibbs, \(\Delta G=\Delta H\,\mbox{--} \,T\Delta S\)) utilizando tres proteínas seleccionadas de tamaño y complejidad crecientes: lisozima, albúmina y fibrinógeno. De hecho, se observó que la adsorción de proteínas a los SCL de colesterol disminuía cuando la temperatura aumentaba de 15 a 40 °C (es decir, en un rango de temperatura en el que se pueden excluir cambios significativos inducidos por la temperatura en la conformación de las proteínas21,22,23), en en contraste con cambios menores en experimentos similares con SAM de tiocolesterol y ácido tiocolénico (controles orientados fijamente de SCL de colesterol debajo de la proteína adsorbida) (Fig. 3a y Datos ampliados Fig. 5a, b). En el equilibrio de adsorción térmica, la dependencia de la temperatura de la energía libre de adsorción de Gibbs se puede utilizar para estimar cuantitativamente la barrera entrópica repulsiva (ΔSchol) a la adsorción de proteínas en las SCL de colesterol. Se realizó un análisis cuantitativo de la adsorción (basado en las pendientes de ΔG(T) en los SCL de colesterol y los controles SAM) para la lisozima, porque los cambios estructurales inducidos por la adsorción son insignificantes para la proteína pequeña y compacta y proporcionaron \(\Delta {S }_{{\rm{chol}}}=-\,200\,\pm \,60\,{\rm{J}}{{\rm{mol}}}^{-1}{{\rm {K}}}^{-1}\) (Datos ampliados, figura 5c y nota complementaria 2)14,24. Este valor de ΔSchol muestra una repulsión entrópica significativa que contrarresta la bioadhesión a las SCL de colesterol. La gráfica de ΔG(T) para los SCL de colesterol muestra una pendiente positiva (es decir, un ΔS negativo de adsorción), lo que indica que la repulsión entrópica sobrecompensa cualquier ganancia entrópica de adsorción de proteínas para ese sistema. Mientras que los procesos determinados por la desorción podrían mostrar una dependencia similar de la temperatura, es bien sabido que la adsorción de proteínas está fuertemente determinada por la adsorción24.

a, Cantidades de lisozima adsorbidas dependientes de la temperatura, determinadas mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. Para los SCL de colesterol, se observó una pronunciada dependencia de la temperatura con respecto a la adsorción de lisozima. Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Media ± sd b, Ilustración esquemática de la transición del colesterol interfacial del estado de orientación fluctuante (no unido) al estado de orientación restringido (unido a proteínas). Se muestra que tres moléculas de colesterol alineadas resaltan la reorientación cooperativa de moléculas vecinas dentro de SCL derivada de consideraciones geométricas y evidenciada por la cinética de tercer orden observada experimentalmente de adaptación interfacial y longitud de correlación de orientación en simulaciones de MD (Notas complementarias 1 y 4). La penalización entrópica de la bioadhesión se puede estimar a partir de la relación entre las áreas interfaciales de restricción y fluctuación, ΔS = R × ln(Aconstr/Afluct), de las moléculas de colesterol, siendo Afluct aproximadamente igual a la dimensión molecular del colesterol debido a la fluctuación orientativa cooperativa y Aconstr relacionado con el área de la sección transversal del colesterol frente a la interfaz en el estado unido a proteínas (Nota complementaria 3). c, simulaciones MD de multicapas de colesterol en contacto con agua, con estado de equilibrio (izquierda) y orientación molecular invertida intencionalmente del 10% de las moléculas en la capa de interfaz (derecha) (para más detalles, consulte la Nota complementaria 4). Los átomos de oxígeno de los grupos hidroxilo se muestran como esferas de color naranja. d, Ángulos entre el vector que conecta los átomos C3 y C17 en el colesterol y el estigmasterol (Datos ampliados, figura 6c y nota complementaria 4) y el eje z para moléculas interfaciales en función del tiempo de simulación para una trayectoria de simulación representativa. En sistemas multicapa de colesterol con un 10% de moléculas revertidas, se observó una reorientación espontánea hacia atrás dentro de 1 µs del tiempo de simulación. No se observó orientación hacia atrás en los controles de estigmasterol. e, Función de correlación (Cr) en función de la distancia a una molécula de referencia, representada para tres trayectorias de simulación de sistemas multicapa de colesterol (sin cambio de orientación de las moléculas en la interfaz). Las barras de error representan sd en ese punto a lo largo de intervalos de tiempo. f, Desviación cuadrática media (RMSD) (para multicapas de colesterol y controles de estigmasterol) en tres trayectorias de simulación del componente z de la posición de todos los átomos de O en la capa de interfaz en función del tiempo para fotogramas cada 0,01 µs, con error barras que denotan sem g, fuerzas de interacción normalizadas entre las puntas de AFM hidrofóbicas y las superficies de colesterol SCL o tiocolesterol SAM. Cada curva contiene 16 puntos de datos registrados secuencialmente en la misma ubicación del sustrato. Se adquirieron conjuntos de datos individuales en diferentes ubicaciones del sustrato. Las curvas están normalizadas al promedio de cada conjunto de datos. Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes.

Datos fuente

Anteriormente se había informado que los efectos de repulsión entrópica se producían debido a la flexibilidad conformacional fijada de los cepillos de oligo(etilenglicol)15 y poli(etilenglicol)16 injertados o al suavizado forzado de las fluctuaciones de altura de las bicapas lipídicas17. En este documento, se sugiere que la repulsión entrópica de las SCL de colesterol es mecanísticamente muy diferente, regida principalmente por fluctuaciones de orientación controladas por la polaridad: la penalización entrópica por la supresión de las fluctuaciones de orientación de las moléculas de colesterol en la interfaz SCL en la adsorción de proteínas se puede estimar relacionando la cruz -área de la sección de colesterol que se enfrenta a las proteínas en la interfaz SCL al área de colesterol libre de orientación en la interfaz SCL-solución (Fig. 3b y Nota complementaria 3) 18,19. El valor obtenido para esta penalización entrópica (–160 J mol–1 K–1) está cerca de la barrera de repulsión entrópica determinada experimentalmente derivada de experimentos de adsorción de proteínas dependientes de la temperatura (–200 J mol–1 K–1). Esta penalización de entropía bastante grande por molécula de lisozima adsorbente, correspondiente a aproximadamente tres enlaces de hidrógeno, enfatiza la relevancia del efecto repulsivo descubierto. En esta estimación de la penalización entrópica, se supuso que tres moléculas interfaciales de colesterol asociadas participaban cooperativamente en las fluctuaciones de orientación, lo que se razonó al principio por consideraciones geométricas del empaquetamiento molecular del colesterol en las SCL. Las mediciones de la fuerza de interacción dependiente del tiempo (Fig. 2a, b) que muestran una cinética de tercer orden respaldan esta suposición porque los datos indican interacciones cooperativas que involucran tres moléculas de colesterol (Fig. 3b).

El análisis de los experimentos de adsorción con las proteínas más grandes, albúmina y fibrinógeno, arrojó valores más bajos para la barrera entrópica repulsiva estimada (probablemente debido a los efectos de la entropía de los cambios conformacionales; Nota complementaria 2). Sin embargo, de manera similar mostró una contribución de entropía negativa (repulsiva) de los SCL de colesterol, lo que indica la relevancia general del mecanismo antiadhesión recientemente identificado.

En un enfoque completamente independiente, las múltiples capas de colesterol en contacto con el agua se exploraron mediante simulaciones de dinámica molecular (MD) y de manera similar mostraron la relevancia de las fluctuaciones de orientación molecular (Nota complementaria 4). Utilizando sistemas multicapa de equilibrio y simulaciones MD dirigidas con orientación invertida de un porcentaje variable de moléculas de colesterol interfaciales, observamos la reorientación espontánea de estas moléculas dentro de un tiempo de simulación de 1 µs, de modo que sus grupos hidroxilo se alinearon nuevamente hacia la capa de agua (Fig. 3c, d y Datos ampliados Fig. 6b,d). Es importante destacar que las simulaciones de control que utilizan el análogo del colesterol estigmasterol (Fig. 4) no mostraron esta reorientación molecular espontánea (Fig. 3c, d y Datos ampliados Fig. 6b, d). La función de correlación de orientación de las moléculas de colesterol en la capa interfacial indicó una rápida decadencia en una distancia de 1 nm (Fig. 3e), lo que confirma la cooperatividad de orientación de unas pocas (dos o tres) moléculas de colesterol como se analizó anteriormente. Junto con la observación de una alta fluctuación vertical de la capa interfacial de las multicapas de colesterol (Fig. 3f), las simulaciones de MD respaldan la opinión de que los SCL de colesterol representan una interfaz molecular altamente dinámica y fluctuante.

Bioadhesión a SCL de análogos de colesterol (los grupos hidroxilo polares se muestran en rojo). Para facilitar la comparación, se introdujo un índice de bioadhesión agregando los resultados de experimentos de adhesión bacteriana con células de E. coli y S. epidermidis y experimentos de adsorción de proteínas con albúmina sérica bovina, lisozima y suero bovino fetal (para ver el conjunto completo de resultados experimentales, consulte Datos ampliados Fig. 10), todos normalizados con los resultados correspondientes para los SCL de colesterol. El valor de referencia se calculó utilizando los respectivos controles de las pruebas de adhesión bacteriana (SiO2) y adsorción de proteínas (oro). AU, unidades arbitrarias.

Datos fuente

Para obtener evidencia experimental directa de fluctuaciones orientativas del colesterol en las interfaces SCL, aplicamos un mapeo de fuerza basado en AFM para detectar la exposición simultánea de residuos polares y no polares de SCL de colesterol sumergidos (Datos ampliados, Fig. 7). Los niveles bajos y altos de fuerzas de interacción entre una punta de AFM hidrófoba y ácido tiocolénico o SAM de tiocolesterol abarcan el rango de fuerzas de interacción detectadas para los SCL de colesterol, lo que confirma que tanto los residuos polares como los no polares están expuestos en la interfaz de los SCL de colesterol sumergidos (Extended Datos Fig. 7c). Las mediciones repetidas de fuerza-distancia en una posición constante mostraron variaciones sustancialmente más altas para los SCL de colesterol que para los SAM de tiocolesterol, lo que proporciona pruebas de fluctuaciones orientativas del colesterol en la interfaz SCL (Fig. 3g y Datos ampliados Fig. 8).

La barrera entrópica descubierta para la bioadhesión resultante de fluctuaciones de orientación en la interfaz de los SCL que contienen colesterol plantea la cuestión de qué características estructurales clave del colesterol subyacen a este efecto.

Por lo tanto, comparamos las características de bioadhesión de las SCL preparadas a partir de análogos de colesterol estructuralmente relacionados (Fig. 4 y Datos ampliados, Fig. 9) en términos de adhesión bacteriana y adsorción de proteínas (Datos ampliados, Fig. 10). Los resultados confirmaron que la anfifilicidad molecular es esencial, pero no suficiente, para una baja bioadhesión (la Fig. 4 muestra los resultados de diferentes ensayos agregados en un índice de bioadhesión) y mostraron que incluso pequeñas desviaciones en la estructura molecular del colesterol pueden disminuir fuertemente su rendimiento antiadhesivo. . Sólo los SCL de deshidrocolesterol, el pariente químico más cercano de los análogos del colesterol probados, se acercaron al índice de bioadhesión de los SCL de colesterol.

Nuestros resultados muestran que el colesterol se ensambla en arreglos moleculares que son capaces de restringir entrópicamente la bioadhesión. Se identificó que la combinación de la anfifilicidad espacialmente desacoplada del colesterol y su alineación efectiva en múltiples capas, generando una movilidad de orientación interfacial cooperativa y de adaptación lenta de los conjuntos, es el requisito previo para una repulsión entrópica pronunciada.

La disminución dependiente del tiempo de reposo en el ángulo de contacto del agua en retroceso indica que, entre el conjunto de análogos de colesterol comparados, solo los SCL de colesterol y deshidrocolesterol cumplen con estos criterios (Datos ampliados, figura 9d). Las mediciones de recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) en SCL de colesterol que proporcionan coeficientes de difusión lateral de 0,3 a 0,4 µm2 s–1 respaldan aún más las características ordenadas, pero de lenta adaptación, del sistema, comparables a los cristales líquidos esmécticos y las membranas lipídicas con alto contenido de colesterol. (Figura complementaria 6)25,26.

De acuerdo con los resultados experimentales, las simulaciones MD muestran que los SCL de análogos con ligeras modificaciones estructurales con respecto al colesterol (Datos ampliados, Fig. 9d) se comportan de manera significativamente diferente, sin rotaciones inversas espontáneas de las moléculas revertidas dentro del tiempo de simulación (Fig. 3d). y datos ampliados Fig. 6b,d). Las simulaciones también indican que las SCL de estigmasterol están sujetas a fluctuaciones interfaciales significativamente más bajas que las SCL de colesterol, lo que sugiere que las interacciones intermoleculares específicas del colesterol proporcionan una alta movilidad interfacial y permiten fluctuaciones moleculares espontáneas (Fig. 3f y Datos ampliados Fig. 6f). Estos hallazgos respaldan firmemente los criterios deducidos experimentalmente para moléculas anfifílicas capaces de generar conjuntos entrópicamente repulsivos.

Al explorar la línea de defensa compositiva de la cutícula antiadhesiva de Collembola, identificamos características fisicoquímicas de las capas que contienen colesterol que resultan en una repulsión entrópica efectiva. Dada la presencia generalizada de colesterol en los límites de los tejidos, nuestros hallazgos pueden arrojar nueva luz sobre procesos interfaciales importantes y ubicuos de la materia viva. El desarrollo de materiales sintéticos y escalables inspirados en el colesterol para controlar la bioadhesión es muy atractivo, pero exige más análisis de los requisitos moleculares que gobiernan este mecanismo recientemente identificado.

Todos los productos químicos (disolventes, lípidos, medios, proteínas, etc.) utilizados en este artículo se adquirieron de Sigma-Aldrich sin purificación adicional, excepto que se indique lo contrario.

Las SCL se prepararon en obleas de silicio (10 × 15 mm2). Los sustratos se limpiaron mediante inmersión en una solución de agua desionizada, amoníaco y peróxido de hidrógeno (fracción de volumen 5/1/1) durante 15 min a 70 °C, se enjuagaron repetidamente en agua Milli-Q y luego se secaron en una corriente de nitrógeno. Los sustratos limpios se utilizaron inmediatamente para la preparación de SCL mediante revestimiento por rotación. Los compuestos se disolvieron en cloroformo a una concentración del 2% en peso (a menos que se indique lo contrario) y el recubrimiento por rotación (LabSpin6, SÜSS MicroTec) se realizó a 3000 rpm s–1 durante 30 s.

Las obleas de silicio se limpiaron como se describe para la preparación de SCL. Los sustratos limpios se recubrieron primero con una capa de adhesión de cromo de 3 nm y luego con una capa de oro de 50 nm mediante deposición química de vapor realizada a 5 × 10–5 mbar (Univex 300, Leybold). Los sustratos de oro se limpiaron mediante inmersión en una solución de agua desionizada, amoníaco y peróxido de hidrógeno (fracción de volumen 5/1/1) durante 15 minutos a 70 °C, se enjuagaron repetidamente en agua Milli-Q y luego se secaron en una corriente de nitrógeno. Para minimizar los defectos, los sustratos de oro se utilizaron para la formación de SAM inmediatamente después de la limpieza. Los compuestos de tiol se disolvieron en etanol (analíticamente puro, pa) hasta una concentración de 1 mM. Antes de su uso, las soluciones de tiol se sonicaron durante 5 a 10 minutos. Los sustratos recubiertos de oro se limpiaron adicionalmente en etanol (pa) durante 30 minutos usando un baño ultrasónico. Posteriormente, las muestras se sumergieron en soluciones de tiol y se incubaron durante 24 h para asegurar el ensamblaje completo. Los contenedores que contenían la solución y las muestras se llenaron con nitrógeno seco y se sellaron para minimizar la exposición al oxígeno. Después de la incubación, las superficies de las muestras se enjuagaron durante 15 a 20 s con etanol (pa), se secaron bajo nitrógeno y se usaron directamente para experimentos adicionales.

Para ver el esquema de reacción, consulte la figura complementaria 1. Se disolvió un equivalente de ácido 3-acetoxi-5-colénico (A) en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) en una atmósfera de argón. La solución se agitó sobre hielo y se añadieron lentamente a la solución seis equivalentes de carbonildiimidazol (B), disueltos en DMSO anhidro. La mezcla de reacción se almacenó a 4ºC durante la noche para su activación. Una solución de 2,5 eq. Se añadió gota a gota cistamina (D) al intermedio de imidazol (C) agitado y enfriado con hielo y se dejó reaccionar durante la noche a temperatura ambiente. El producto (E) se purificó, se liofilizó, se disolvió en etanol y se diluyó en agua antes de la adición de NaOH 1 M para obtener la escisión del éster. Después de la purificación y liofilización, el producto (F) se disolvió nuevamente en etanol y se diluyó en agua. El enlace disulfuro se escindió mediante la adición de un exceso de seis veces de clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina a ácido colénico en una solución acuosa a pH neutro. El producto de escisión (G) se purificó y liofilizó (pureza de alrededor del 80%). Para el control y la purificación de la reacción/pureza, se utilizó cromatografía líquida de alto rendimiento (RP-HPLC) de fase inversa con un gradiente lineal de acetonitrilo en agua con aditivo ácido fórmico o trifluoroacético. El instrumento analítico de HPLC (1260 Infinity II, Agilent) estaba equipado con un detector de matriz de diodos (210 y 278 nm) y un detector de tiempo de vuelo de ionización por pulverización de electrones (ESI-TOF). El instrumento de HPLC preparativo (serie 1200, Agilent) utilizó un detector de matriz de diodos y un recolector de fracciones en modo de recolección manual.

El contenido de carbono orgánico total (TOC) de las soluciones se analizó utilizando un analizador de TOC de laboratorio Sievers 5310C (GE Analytical Instruments) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La información sobre la preparación de muestras se proporciona en la figura complementaria 4.

S. epidermidis (cepa PCI 1200, ATCC) y E. coli (cepa W3110) se cultivaron durante la noche a partir de colonias individuales en caldo de lisogenia (LB) a 37 °C y 200 rpm. Los cultivos nocturnos se centrifugaron a 4.000 g durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento restante se resuspendió en LB. Esta etapa de lavado se repitió tres veces. Las densidades celulares se ajustaron a una densidad óptica (OD600) de 0,2 en LB fresco y los sustratos de muestra se incubaron en la solución bacteriana durante 1 h a 37 °C (sin agitación). Después de la incubación, las bacterias adherentes se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos, se lavaron en PBS fresco y agua Milli-Q y se secaron bajo nitrógeno. Las muestras se recubrieron con una capa de oro de 15 nm (SCD 050, Balzers) y se tomaron imágenes mediante microscopía electrónica de barrido (SEM; XL30 ESEM-FEG, Philips/FEI) en modo de alto vacío a un voltaje de aceleración de 5 kV. Para cada muestra, se adquirieron al menos seis imágenes en posiciones aleatorias y las células se contaron utilizando la herramienta de conteo en Fiji27. Las barras de escala de las imágenes SEM se utilizaron para calibrar el ancho de píxeles. Se utilizó el complemento 'contador de células' de Fiji para contar el número de células en el área calculada (aproximadamente 103 µm2). Los números contados se normalizaron con respecto al valor medio de la referencia de silicio para comparaciones relativas o se ampliaron a células por milímetro cuadrado para valores absolutos.

Las mediciones de la microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) se realizaron utilizando un QCM-D modelo E4 (Biolin Scientific) equipado con un sistema de bomba peristáltica (IPC, Ismatec). Para las mediciones de QCM se utilizaron cristales de cuarzo recubiertos de oro (QSX301, Quantum Design) con una frecuencia de resonancia de 5 MHz. Las SCL y SAM se prepararon en cristales de QCM como se describe anteriormente. Todas las mediciones se realizaron a un caudal de 100 µl min-1. Se adsorbieron soluciones proteicas (lisozima, albúmina sérica bovina y fibrinógeno (100 µg de proteína ml–1 PBS)) o suero bovino fetal al 10% en volumen (Merck) en PBS en las muestras en capas durante 1 h y posteriormente se sometieron a un régimen de desorción durante 30 minutos. min con PBS. Los cambios de frecuencia y disipación inducidos por las proteínas adsorbidas se registraron en tiempo real en los armónicos tercero, quinto, séptimo, noveno, 11 y 13 (15, 25, 35, 45, 55 y 65 MHz, respectivamente). La masa de proteína adsorbida se calculó utilizando la ecuación de Sauerbrey28 con el software Q-Sense DFind (Biolin Scientific).

Las mediciones del ángulo de contacto se realizaron utilizando un sistema óptico de análisis de contorno y medición del ángulo de contacto OCA 30 equipado con una cámara de temperatura controlada TPC 160 (DataPhysics Instruments). Se dispensaron y redispensaron gotas de agua desionizada desgasificada a velocidades variables de 0,3 a 2,0 µl s–1 para monitorear los ángulos de contacto de avance y retroceso y su comportamiento dependiente del tiempo.

Las mediciones de elipsometría se realizaron con un elipsómetro M-2000 (JA Woollam) equipado con una lámpara QTH de 50 W que opera en longitudes de onda de 371 a 1000 nm y un ángulo de incidencia de 75°. El espesor de la capa de óxido de la oblea de silicio se determinó mediante elipsometría antes del montaje de la capa. El espesor de las capas ensambladas se calculó mediante un modelo óptico que incluía tres capas: Si, SiO2 y una capa de Cauchy.

Para ATR-FTIR in situ, se recubrieron por rotación 500 µl de una solución de colesterol y cloroformo al 2% sobre un cristal de ATR de germanio. La caracterización de los SCL de colesterol depositados mediante ATR-FTIR in situ se realizó como se describió anteriormente29. La espectroscopia ATR-FTIR in situ se realizó utilizando la técnica de referencia de muestra de haz único para obtener espectros ATR-FTIR compensados ​​en ambientes secos y acuosos30,31. Las mediciones dicroicas se realizaron según un método descrito previamente32. La luz infrarroja se polarizó mediante un polarizador de rejilla de alambre (SPECAC). El accesorio ATR-FTIR se operó en un espectrómetro IFS 55 Equinox (BRUKER Optics) equipado con una fuente Globar y un detector de telururo de mercurio-cadmio. Los espectros polarizados P y s se registraron a partir de SCL de colesterol seco. Las altas proporciones dicroicas de la banda n (CO) del grupo principal de colesterol COH se pueden verificar en la línea de las mediciones de dicroísmo ATR-FTIR de las bicapas lipídicas. La relación dicroica R = AP/AS, con absorbancia Ap medida en polarización p y AS medida en polarización s, de bandas infrarrojas con un momento dipolar de transición (M) ubicado perpendicular al plano de la superficie también mostró valores altos, con R > 4. Brevemente, bajo condiciones de ATR en la interfaz del medio denso (Si) y el medio raro (aire), se estableció una onda evanescente con un campo eléctrico dividido en los tres componentes del campo eléctrico, Ex, Ey y Ez, que interactúan. con, por ejemplo, capas orgánicas adyacentes. La luz infrarroja polarizada en paralelo (EP) forma Ex y Ez, mientras que la luz polarizada verticalmente (ES) forma Ey. Se obtienen valores altos de R o Ap cuando la M de un grupo funcional dentro de la capa orgánica es paralela a Ez (fuera del plano), mientras que se obtienen valores bajos de R o AS altos cuando M es paralela a Ey (en el plano). lo cual se debe al producto escalar \(A=E\times M=E\times M\times \cos (E,M)\) de los vectores E y M.

La espectrometría de masas de iones secundarios de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) se realizó con un instrumento ToF-SIMS 5-100 equipado con una pistola de iones de metal líquido Bi de 30 kV (IONTOF). Los datos se adquirieron en modo Bi3++ y se calibraron con respecto a una lista de picos de referencia (SurfaceLab7, IONTOF). El área de análisis fue de 300 × 300 µm2, que se escaneó en 128 × 128 píxeles. La profundidad de muestreo de esta técnica es tan baja como unos pocos nanómetros, es decir, sólo las capas moleculares superiores de la muestra contribuyen al análisis. Se seleccionaron señales características de colesterol (relación masa-carga, m/z = 369,3) y palmitato de estearilo (m/z = 257,2) para la caracterización semicuantitativa de los SCL.

Aplicamos un protocolo FRAP descrito previamente para analizar coeficientes de difusión y fracciones móviles con un microscopio de barrido láser confocal de fluorescencia utilizando la herramienta FRAP (SP5, Leica)33,34. Para las mediciones de FRAP, se prepararon SCL de colesterol fluorescentes mediante la adición de 1/100 o 1/20 de colesterol NBD (ThermoFisher) a soluciones de colesterol puro (2% en peso) y se recubrieron por centrifugación para limpiar no. 1,5 cubreobjetos de vidrio (Corning). Posteriormente, las SCL de colesterol se sumergieron en agua desionizada o PBS, y se realizó FRAP fotoblanqueando un punto definido con un diámetro de 10 ± 1 µm utilizando el siguiente protocolo: diez imágenes antes del blanqueamiento seguidas de un rayo láser de alta potencia con blanqueamiento posterior durante 4 s para lograr una zona completamente blanqueada. La recuperación se registró con un objetivo de inmersión en aceite con apertura numérica de 40 ×/1,4 a una velocidad de adquisición de imágenes de 1 s por cuadro a 256 × 256 píxeles, para un total de 300 s (SP5, Leica). El lapso de tiempo resultante se analizó utilizando el programa frap_analysis35 de MATLAB (MathWorks).

Todas las mediciones de AFM se realizaron con un AFM NanoWizard IV (JPK Instruments). Los voladizos utilizados fueron calibrados antes de las mediciones. Las mediciones se realizaron en PBS a temperatura ambiente (25 °C), salvo que se indique lo contrario.

La topografía de las superficies en capas se registró utilizando el modo de imágenes cuantitativas del instrumento AFM utilizando voladizos qp-BioAC (nanosensores). Los parámetros de adquisición empleados fueron los siguientes: rampa de 300 nm, tiempo de píxel de 10 ms y disparo de fuerza de 100 pN. Se registraron imágenes de 30 × 30 µm2 con una resolución de 256 × 256 píxeles. Se utilizó el software de procesamiento de datos proporcionado por el fabricante del AFM (JPK Instruments) para extraer la rugosidad de la superficie (Ra) de las imágenes topográficas.

Para mediciones con sonda coloidal, se conectaron perlas de sílice individuales (Kisker Biotech, Ø10 µm) a un voladizo sin punta (PNP-TR-TL-Au, Nanoworld, constante de fuerza nominal 0,08 N m–1) como se describió anteriormente36. Los voladizos de AFM modificados con sonda coloidal se limpiaron en isopropanol y el agua adsorbida se eliminó calentando a 120 °C durante 10 minutos. La sonda coloidal se hidrofobizó mediante incubación en vapor de hexametildisilazano durante 12 h y posterior calentamiento a 120 °C durante 1 h. Los parámetros de espectroscopía de fuerza empleados fueron los siguientes: fuerza de punto de ajuste de 3 nN, velocidad de aproximación/retracción de 5 µm s–1 y distancia de tracción de 5 µm. Las fuerzas de interacción se extrajeron de las curvas fuerza-distancia de retracción utilizando datos del software de procesamiento proporcionado por el fabricante del AFM.

El voladizo AFM modificado con sonda coloidal (ver sección 'Espectroscopia de fuerza de sonda coloidal') se convirtió en adhesivo celular mediante la aplicación de un recubrimiento de polidopamina, y se unieron células individuales de E. coli con proteína fluorescente verde citoplásmica (cepa MG1655 eGFP) como se describió anteriormente37. Las mediciones se realizaron a 37 °C utilizando un PetriDishHeater (JPK Instruments). Se utilizaron los mismos parámetros de espectroscopia de fuerza y ​​rutinas de procesamiento de datos para las mediciones de espectroscopia con sonda coloidal. Solo se analizaron conjuntos de datos en los que la posición y orientación de la célula bacteriana en el voladizo del AFM no cambiaron antes y después de las mediciones (es decir, las condiciones de contacto/geometría fueron constantes durante la medición).

Las mediciones se realizaron utilizando el modo de imágenes cuantitativas del instrumento AFM utilizando voladizos qp-BioAC (CB-2, nanosensores). Los voladizos se hidrofobizaron mediante incubación en vapor de hexametildisilazano como se describió anteriormente o se hidrofilizaron mediante limpieza con plasma (Harrick Plasma) durante 10 minutos. Los parámetros de adquisición utilizados fueron los siguientes: rampa de 100 nm, tiempo de píxel de 20 ms y disparo de fuerza de 500 pN. Se registraron imágenes de 5 × 5 µm2 con una resolución de 50 × 50 píxeles en diferentes ubicaciones de la superficie de la muestra. Las fuerzas de interacción se extrajeron de las curvas fuerza-distancia de retracción utilizando el software de procesamiento de datos proporcionado por el fabricante del AFM.

Las mediciones de espectroscopia de fuerza dependiente del tiempo se realizaron con voladizos qp-BioAC hidrofobizados (ver sección anterior) (CB-2, nanosensores). Los parámetros de espectroscopía de fuerza empleados fueron los siguientes: fuerza de punto de ajuste de 1 nN, velocidad de aproximación/retracción de 1 µm s–1 y distancia de tracción de 200 nm. Se mantuvo un período de espera de 20 s entre las 16 mediciones consecutivas realizadas en un solo lugar de la superficie de la muestra, para minimizar la influencia de las mediciones sobre la dinámica de las moléculas de colesterol. Las mediciones se repitieron en diferentes lugares de la muestra. Las fuerzas de interacción se extrajeron de las curvas fuerza-distancia de retracción utilizando el software de procesamiento de datos proporcionado por el fabricante del AFM.

Se modelaron SCL de colesterol o estigmasterol con cuatro capas moleculares, es decir, dos capas dobles (Datos ampliados, figura 6a). En la interfaz de dos capas dobles se enfrentan los grupos hidroxilo hidrófilos del colesterol o del estigmasterol; en la interfaz, los grupos hidroxilo miran hacia la capa de agua. La interfaz normal de doble capa-agua estaba a lo largo del eje z en todas las simulaciones. Para modelar un sustrato sólido en la parte inferior del SCL, se restringió el movimiento de las moléculas en el plano xy para las moléculas lipídicas más bajas. Las dimensiones de la caja de simulación fueron 7,1554 × 7,1554 × 50 nm3. Se incluyeron paredes hidrofóbicas, modeladas como potencial directo de 12-6 LJ en z = 0 y z = 50 nm, en la parte inferior y superior del cuadro de simulación a lo largo del eje z. Las capas de vacío por encima y por debajo de la multicapa evitan interacciones no unidas de corto alcance entre el agua y la pared y los lípidos y la pared.

Las moléculas de colesterol y estigmasterol se modelaron con el campo de fuerza CHARMM3638,39. Se utilizó el modelo de agua TIP3P en CHARM40,41,42 e incluyó sal de KCl en las simulaciones. Primero, se construyeron capas dobles de colesterol o estigmasterol en CHARMM-GUI, donde las colas hidrofóbicas se enfrentan entre sí43,44. Los parámetros del campo de fuerza CHARMM36 para colesterol y estigmasterol, los parámetros del agua TIP3P y los parámetros para iones se obtuvieron de CHARMM-GUI. Cada capa de la doble capa de colesterol o estigmasterol contenía 128 moléculas. La doble capa obtenida de CHARMM-GUI se tradujo a lo largo del eje z en 4 nm utilizando el programa de visualización Visual Molecular Dynamics45, construyendo multicapas de cuatro capas que contienen 512 moléculas de lípidos en total (Datos extendidos, Fig. 6a). Se agregaron agua e iones encima de las multicapas. El sistema multicapa de colesterol contenía 12.284 moléculas de agua con 72 iones K+ y Cl- y el sistema multicapa de estigmasterol contenía 12.363 moléculas de agua con 74 iones K+ y Cl-. Se minimizó la energía del sistema y se realizaron simulaciones de equilibrio para los sistemas que contienen colesterol y estigmasterol utilizando Gromacs 2019.4 (para más detalles, consulte la Nota complementaria 4)46,47.

Para construir los sistemas con una orientación molecular invertida en la interfaz (capa superior), se invirtió la orientación del 10% (13 moléculas), el 30% (39 moléculas) y el 50% (64 moléculas) de las moléculas en comparación con el sistema de equilibrio. La herramienta Alchembed48 se utilizó para eliminar cualquier superposición entre coordenadas que pudiera haber aparecido al revertir la orientación de las moléculas. Luego se llevaron a cabo ejecuciones cortas de minimización y equilibrio como se describe anteriormente (para más detalles, consulte la Nota complementaria 4).

Todos los datos generados durante este estudio se proporcionan en https://is.gd/3cdZ6f. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a SW Grill, P. Fratzl, DJ Müller y K. Simons por sus comentarios tan útiles y alentadores sobre nuestro estudio. Agradecemos a D. Hahn, M. Nitschke y M. Müller por la síntesis de ácido tiocolénico, por realizar mediciones ToF-SIMS y por realizar mediciones ATR-FTIR, respectivamente. LDR agradece el apoyo de la Fundación Volkswagen. Agradecemos a C. Neinhuis por llamar nuestra atención sobre las características intrigantes de la cutícula de Collembola.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Leibniz para la Investigación de Polímeros Dresden eV

Instituto de Materiales Polímeros Biofuncionales, Instituto Leibniz de Investigación de Polímeros de Dresde, Dresde, Alemania

Jens Friedrichs, Ralf Helbig, Julia Hilsenbeck, Lars David Renner, Tilo Pompe y Carsten Werner

Instituto de Teoría de Polímeros, Instituto Leibniz de Investigación de Polímeros de Dresde, Dresde, Alemania

Prithvi Raj Pandey y Jens-Uwe Sommer

Clúster de Excelencia Física de la Vida y Centro de Terapias Regenerativas de Dresde, Universidad Técnica de Dresde, Dresde, Alemania

Jens-Uwe Sommer y Carsten Werner

Instituto de Bioquímica, Universidad de Leipzig, Leipzig, Alemania

Tilo Pompe

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JF, RH, JH, TP y LDR diseñaron y realizaron experimentos y analizaron datos. PRP y J.-US realizaron simulaciones de dinámica molecular. JF, RH, JH, TP, J.-US, LDR y CW escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Carsten Werner.

JF, RH, LDR, TP, J.-US y CW figuran como coinventores en la solicitud de patente núm. 10 2022 104 237,5. Los demás autores no declaran tener intereses en conflicto.

Nature agradece a Mingjie Liu, José Luis Toca-Herrera y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Estructuras moleculares de lípidos detectados en la cutícula de Collembola T. bielanensis7 y lípidos utilizados en la preparación de SCL y SAM. Los SCL se prepararon a partir de colesterol, ácido palmítico y esteárico y palmitato de estearilo. En la cutícula se han detectado colesterol y ácido palmítico y esteárico, y el palmitato de estearilo es un sustituto del compuesto detectado palmitato de linoleilo, que no estaba disponible en cantidades suficientes como material sintético. Mientras que ambos ésteres de cera tienen la misma longitud de cadena de hidrocarburos, el palmitato de linoleilo tiene dos dobles enlaces adicionales. Otros lípidos detectados en la cutícula no estaban disponibles como material sintético o no eran adecuados para la preparación de SCL (es decir, el ácido oleico y linoleico son líquidos a temperatura ambiente y se humedecen inmediatamente sobre el sustrato después del recubrimiento por rotación). Los SAM se prepararon utilizando lípidos terminados en tiol estructuralmente similares a algunos de los lípidos detectados en la cutícula de Collembola. En el tiocolesterol, el grupo hidroxilo en el tercer átomo de carbono del anillo hidrocarbonado A del colesterol se reemplaza por un grupo tiol y en el ácido colénico, la estructura del colesterol se modifica químicamente para llevar un grupo tiol al final de la cadena hidrocarbonada unida al 17. átomo de carbono del anillo de hidrocarburo D (para obtener detalles sobre la tiolación del ácido colénico, consulte la figura complementaria 1). El hexadecanotiol, el octadecanotiol y el octadecenotiol son análogos de los ácidos grasos detectados en la cutícula, mientras que el hexanoato de tiohexilo representa un sustituto de cadena corta del palmitato de estearilo.

( a ) Espesor de la capa, (b) rugosidad de la superficie (Ra) y (c) morfología de las capas lipídicas cuticulares de Collembola determinadas por elipsometría (espesor de la capa) y microscopía de fuerza atómica (rugosidad de la superficie y morfología). Todas las imágenes del panel (c) tienen la misma escala. ( d, e ) Densidad de células adherentes normalizada de (d) S. epidermidis y (e) E. coli. Los datos se normalizan con respecto a la densidad celular adherente promedio en el sustrato de SiO2. (f,g) Cantidad adsorbida de (f) lisozima y (g) albúmina sérica bovina determinada mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. En todos los gráficos se muestra la media + la desviación estándar. Se indica el número de observaciones (n). Los valores de P (comparaciones con la condición de colesterol SCL) se determinaron mediante pruebas ANOVA unidireccionales.

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(a) Espesor de la capa, (b) rugosidad de la superficie (Ra) y (c) morfología de SCL multicomponentes que contienen palmitato de estearilo y colesterol en diversas proporciones en peso según lo determinado por elipsometría (espesor de la capa) y microscopía de fuerza atómica (rugosidad de la superficie y morfología). . Todas las imágenes del panel (c) tienen la misma escala. ( d ) Densidad de células adherentes normalizada de E. coli. Los datos se normalizan con respecto a la densidad celular adherente promedio en el sustrato de SiO2. (e,f) Cantidad adsorbida de (e) lisozima y (f) albúmina sérica bovina determinada mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. Se indica el número de observaciones (n). Los valores de P (comparaciones con la condición "0/100") se determinaron mediante pruebas ANOVA unidireccionales. (g) Señales ToF-SIMS características de colesterol (m/z 369,3) y palmitato de estearilo (m/z 257,2), de SCL multicomponentes, en función de la composición de la capa. El enjuague de las muestras con agua Milli-Q no produce cambios significativos en las señales detectadas, eliminando así la posibilidad de que la disposición espacial del colesterol y el palmitato de estearilo cambie al entrar en contacto con fluidos polares (es decir, el enriquecimiento interfacial del colesterol en SCL multicomponentes sumergidos puede ser excluidos por sus propiedades antibioadhesivas). En los gráficos (ab, df), se muestran la media + la desviación estándar. (h) Contacto de las fuerzas de interacción dependientes del tiempo (determinadas mediante espectroscopia de fuerza basada en AFM) entre una sonda coloidal hidrófoba (perla de sílice de ∅10 µm modificada con silano hidrófobo) y la superficie de SCL multicomponente. La media y el error estándar ± de la media se muestran en el gráfico (h).

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( a – c ) Mediciones dinámicas del ángulo de contacto en capas de lípidos cuticulares de Collembola ((a) SCL, (b) SAM y (c) SCL multicomponente). Para cada tipo de muestra, se muestran el ángulo de contacto de avance (θadv) y de retroceso (θrec). Para algunas muestras, la fuerte fijación de la línea de contacto trifásica después de un período de reposo de 20 s (es decir, θrec está cerca de 0°) se indica adicionalmente mediante una flecha. Aunque los ácidos palmítico y esteárico también son anfifílicos, no se observó ninguna disminución dependiente del tiempo de reposo en el ángulo de contacto de retroceso para los SCL de ninguno de estos compuestos. Se puede suponer que la estructura molecular lineal de los ácidos grasos (a diferencia de la estructura esteroide voluminosa del colesterol) provoca un empaquetamiento más apretado de las moléculas en el SCL, lo que limita la movilidad de las moléculas. En todos los gráficos se muestra la media + la desviación estándar. (d) Mediciones sucesivas del ángulo de contacto en la misma posición en un SCL de colesterol, donde el sitio de medición se seca con nitrógeno entre dos mediciones. Se obtienen resultados consistentes (es decir, un ángulo de contacto de avance hidrófobo y ningún ángulo de retroceso después de un período de reposo de 20 s). Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes.

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Cantidades adsorbidas dependientes de la temperatura de (a) albúmina sérica bovina y (b) fibrinógeno determinadas mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. Para los SCL de colesterol, se observa una pronunciada dependencia de la temperatura en la adsorción de proteínas. Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes. Se muestran la media ± desviaciones estándar. (c) La dependencia de la temperatura de la energía libre de adsorción de Gibbs se deriva de la cantidad de lisozima adsorbida en mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo (Fig. 3a). Los puntos de datos se calcularon con ΔG = –RT × ln(q/(c* – c*q)), donde R es la constante universal de los gases, T la temperatura absoluta, q la fracción superficial adsorbida y c* la concentración de proteína normalizada. (c* = 6,8·10–6). Las fracciones de superficie se calcularon como la relación entre la cantidad determinada experimentalmente y la cantidad máxima de monocapas saturadas de lisozima adsorbida (para una explicación detallada, consulte la Nota complementaria 2). Se muestran los errores estándar ± promedio derivados de las mediciones de adsorción de proteínas (al menos tres experimentos independientes). Los coeficientes de determinación (R2) para ajustes lineales de la determinación del primer principio de la barrera entrópica ΔS (por ΔG = ΔH – T ΔS) también se dan en la figura.

(a) El panel izquierdo muestra el cuadro de simulación de un sistema con cuatro capas de colesterol o estigmasterol en contacto con una capa de agua y vacío arriba y abajo. Las paredes hidrofóbicas estaban en z = 0 y z = 50 nm. El panel derecho muestra el sistema multicapa lipídico-agua dentro del cuadro de simulación. Para mayor claridad, no se muestran los iones de sal dentro de la capa de agua. Los átomos de oxígeno en el grupo hidroxilo hidrofílico del colesterol o del estigmasterol se muestran como esferas y las colas hidrofóbicas como barras azules. (b) Instantáneas de simulación a 0 y 1 µs de una trayectoria de dinámica molecular (MD) para sistemas multicapa de colesterol y estigmasterol en contacto con agua con estados de equilibrio (0% de moléculas rotadas) y orientación molecular invertida intencionalmente de 10, 30 y 50% de moléculas en la capa de interfaz. A 0 µs, las simulaciones de producción se iniciaron después de realizar múltiples pasos de equilibrio (para más detalles, consulte Métodos y Nota complementaria 4). (c) Representación visual del vector que conecta los átomos C3 y C17 del colesterol o el estigmasterol. Este vector se utiliza como director para cada molécula en el análisis de correlación y el cálculo del ángulo de las moléculas en la capa de interfaz (en relación con el eje z). (d) Ángulos entre el vector que conecta los átomos C3 y C17 y el eje z de una trayectoria de simulación representativa para sistemas multicapa lipídicos con 10, 30 y 50% de moléculas revertidas. Los sistemas multijugador de colesterol muestran una reorientación espontánea dentro de 1 µs del tiempo de simulación, mientras que no se observa ninguna reorientación para los controles de estigmasterol. (e) Función de correlación (Cr) en función de la distancia a una molécula de referencia, representada para tres trayectorias de simulación de sistemas multicapa de estigmasterol (sin cambio de orientación de las moléculas en la interfaz), respectivamente. Las barras de error en cada punto representan la desviación estándar en ese punto durante los intervalos de tiempo. (f) El histograma de RMSD medio en tres trayectorias de simulación del componente z de la posición de todos los átomos de oxígeno en la capa de interfaz en el rango de tiempo de 0,5 a 1 µs muestra una mayor fluctuación de la interfaz para el sistema multicapa que contiene colesterol.

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(a) Se aplicó un mapeo de fuerza de alta velocidad basado en AFM (Quantitative Imaging™, ver Métodos) para detectar la exposición simultánea de residuos moleculares polares (es decir, el grupo hidroxilo del colesterol) y no polares (es decir, la cadena de hidrocarburos del colesterol) en el Interfaz sólido-líquido de SCL de colesterol sumergidos en un líquido polar. Utilizando puntas de AFM polares (mediante la aplicación de plasma de O2 en una cámara de plasma) o no polares (recubrimiento de hexametildisilazano) (ver (b)), se cuantificaron las fuerzas de interacción en un patrón de cuadrícula en SCL de colesterol, SAM de tiocolesterol (es decir, con el hidrocarburo de colesterol no polar cadena permanentemente expuesta) y SAM de ácido tioclénico (es decir, con el grupo hidroxilo del colesterol polar permanentemente expuesto). Se muestran esquemáticamente las proporciones de tamaño entre una punta de AFM y una molécula de colesterol individual. Aunque la punta del AFM es muy afilada (el radio de curvatura típico de la punta es inferior a 10 nm), sigue siendo significativamente más grande que una sola molécula de colesterol. Así, las curvas individuales de fuerza-distancia registran las interacciones integradas de varias moléculas de colesterol. Las curvas de fuerza-distancia se adquirieron a una frecuencia alta (es decir, unos pocos milisegundos por curva de fuerza-distancia) que es suficientemente más rápida que el tiempo medido para el equilibrio hidrofóbico (es decir, unos pocos segundos, Fig. 2c), capturando así una "instantánea". de la orientación de la superficie molecular. (c) Para las puntas de AFM no polares, se encontraron distribuciones de las fuerzas de interacción dependientes de la superficie. Para los SAM de ácido tiocolénico, se detectaron fuerzas de interacción predominantemente bajas. Las pocas fuerzas superiores pueden resultar de interacciones de la punta del AFM con la parte no polar de la molécula de ácido tiocolénico, que puede volverse accesible debido a la deformación o defectos del SAM. Debido a las interacciones hidrofóbicas entre la punta del AFM no polar y la cola de hidrocarburo no polar expuesta de la molécula de tiocolesterol, se detectaron fuerzas de interacción significativamente mayores para los SAM de tiocolesterol. Para las SCL de colesterol, se observó que las fuerzas de interacción abarcaban el rango de fuerzas medidas para los dos SAM estudiados, lo que respalda la hipótesis de que tanto los residuos polares como los no polares están expuestos en las SCL de colesterol sumergidas. (d) Para las puntas polares de AFM, no se detectaron diferencias entre las superficies probadas. Los datos se obtuvieron de al menos tres experimentos independientes.

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(a) Las fuerzas de interacción de una punta de AFM no polar (consulte Datos ampliados, figura 7b) con SCL de colesterol y SAM de tiocolesterol se cuantificaron repetidamente en una ubicación singular en la superficie de la muestra. Para minimizar la influencia de la punta del AFM en la dinámica de las moléculas de colesterol interfaciales, los parámetros de medición se eligieron de tal manera que se mantuviera una pausa de 20 s entre dos mediciones consecutivas. Se obtuvieron dieciséis mediciones consecutivas de fuerza-distancia por posición con alta repetibilidad espacial para garantizar que un conjunto idéntico de moléculas de superficie contribuyera a la interacción con la punta del AFM. Se analizaron al menos seis ubicaciones diferentes por condición en tres superficies de muestra independientes. (b) Gráfica de las fuerzas de interacción absolutas para todas las series de mediciones. El número consecutivo de curvas de fuerza-desplazamiento medidas en un solo punto y el tiempo transcurrido se trazan en los ejes x inferior y superior, respectivamente. Las series de mediciones individuales se normalizaron al valor medio de cada serie. Los valores resultantes se representan en (c). (d) La distribución de las desviaciones estándar relativas determinadas a partir de las curvas individuales en (c). Se muestran la media + la desviación estándar. (e) Pendientes promedio de regresiones lineales ajustadas a las series de mediciones individuales presentadas en (c). Sólo hay evidencia marginal de un cambio sistemático en las fuerzas de interacción en el transcurso de una serie de mediciones individuales (es decir, el registro de 16 curvas de fuerza-distancia en una posición de la muestra), por lo que cualquier influencia del proceso de medición debido al desgaste o Se puede excluir la contaminación de la punta AFM modificada o de la superficie de la muestra. Se muestra la media ± desviación estándar. Se indica el número de observaciones (n). Los valores de P se determinaron mediante pruebas t no apareadas.

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(a) Espesor de la capa, (b) rugosidad de la superficie y (c) morfología de los SCL análogos del colesterol determinados por elipsometría y microscopía de fuerza atómica. Las imágenes de microscopía de fuerza atómica en modo de contacto en (c) se utilizaron para determinar la rugosidad de la superficie. Si bien todas las SCL tienen un espesor relativamente uniforme de 150 a 200 nm, su morfología y rugosidad varían. Sin embargo, se excluye una influencia significativa de las propiedades morfológicas de la superficie sobre las propiedades de bioadhesión, ya que, por ejemplo, las SCL de colesterol y deshidrocolesterol muestran una rugosidad superficial muy divergente pero propiedades de bioadhesión muy similares (ver Datos ampliados, Fig. 10). (d) Mediciones dinámicas del ángulo de contacto de los SCL análogos del colesterol. Para SCL de análogos de colesterol no anfifílicos, solo una histéresis del ángulo de contacto dependiente de la rugosidad de la superficie (es decir, cuanto más rugosa es la superficie, mayor es la histéresis debido a los efectos de fijación en las elevaciones de la superficie), pero ninguna disminución del contacto de retroceso dependiente del tiempo de reposo. Se observa un ángulo (es decir, una adaptación dinámica de la polaridad interfacial en respuesta a cambios en la polaridad del entorno). Sólo en el caso de los SCL de colesterol y deshidrocolesterol se pudo detectar una disminución del ángulo de contacto de retroceso dependiente del tiempo de contacto. En todos los gráficos se muestran la media y + desviación estándar. Se indica el número de observaciones (n).

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Densidad de células adherentes normalizada de (a) S. epidermidis y (b) E. coli en SCL análogos del colesterol. Los datos se normalizan con respecto a la densidad celular adherente promedio en el sustrato de SiO2. (c,d,e) Cantidad adsorbida de (c) lisozima, (d) albúmina sérica bovina y (e) suero bovino fetal al 10% en SCL análogos de colesterol según lo determinado mediante mediciones de microbalanza de cristal de cuarzo. En todos los gráficos se muestra la media + la desviación estándar. Se indica el número de observaciones (n). Los valores de P (comparación con la condición del colesterol) se determinaron mediante pruebas ANOVA unidireccionales.

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Este archivo contiene Figs complementarias. 1–8, Tablas 1–3, Notas 1–4 y Referencias.

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Secuencia de vídeo de una medición dinámica del ángulo de contacto del agua en la superficie de un SCL de colesterol. El alto ángulo de contacto de avance refleja una superficie hidrofóbica. Tras la retirada inmediata de la gota (sin período de reposo), se observa un ángulo de contacto de retroceso ligeramente reducido pero aún alto.

Secuencia de vídeo de una medición dinámica del ángulo de contacto del agua en la superficie de un SCL de colesterol. El alto ángulo de contacto de avance refleja una superficie hidrofóbica. No se observa ningún retroceso de la línea de contacto trifásica cuando se retira la gota de agua después de un período de reposo de 20 s. Luego se retrae la gota de agua. Se observaron oscilaciones en la línea de contacto trifásica durante el período de descanso de 20 s.

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Reimpresiones y permisos

Friedrichs, J., Helbig, R., Hilsenbeck, J. et al. La repulsión entrópica de las capas que contienen colesterol contrarresta la bioadhesión. Naturaleza 618, 733–739 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06033-4

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Recibido: 01 de febrero de 2021

Aceptado: 30 de marzo de 2023

Publicado: 21 de junio de 2023

Fecha de emisión: 22 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06033-4

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